Ký sinh trùng Plasmodium falciparum kháng artemisinin: một quá trình liên quan đến trạng thái ngủ

Định nghĩa kháng ART (WHO, 2010a)

Bệnh nhân đáp ứng các tiêu chí sau đây được phân loại như là một bệnh nhiễm ký sinh trùng kháng thuốc artemisinin:

+ Ký sinh trùng còn dai dẳng sau 7 ngày điều trị hoặc tái phát trong vòng 28 ngày sau khi bắt đầu điều trị.

+ Nồng độ dihydroartemisinin trong huyết tương vẫn còn đầy đủ.

+ Thời gian để làm sạch ký sinh trùng kéo dài.

+ Ký sinh trùng giảm nhạy cảm in vitro với dihydroartemisinin.

Định nghĩa hiện hành về kháng ART (WHO, 2010a)

Sự gia tăng thời gian làm sạch ký sinh trùng, bằng chứng là 10% các trường hợp còn ký sinh trùng được phát hiện vào ngày thứ 3 sau khi điều trị với một ACT (nghi ngờ kháng);

Thất bại điều trị sau khi điều trị bằng artemisinin đơn trị liệu dùng đường uống với nồng độ thuốc còn đầy đủ trong máu, bằng chứng là sự tồn tại dai dẳng của ký sinh trùng trong vòng 7 ngày, hoặc sự hiện diện của ký sinh trùng vào ngày thứ 3 và tái phát trong vòng 28/42 ngày (xác nhận kháng).

Sự xuất hiện kháng ART (artemisinin) luôn là mối quan tâm sâu sắc ngay từ khi ACTs ra đời và đưa vào sử dụng trên toàn thế giới vào năm 2001. Kháng thuốc được xem là gần như không thể tránh được và sẽ phát triển như trong lịch sử cho thấy ký sinh trùng đã phát triển kháng với tất cả các thuốc chống sốt rét đã được sử dụng rộng rãi khác. Từ lâu ART được đề xuất nên kết hợp với các thuốc khác trong điều trị để làm chậm sự phát triển của kháng thuốc và nguyên lý này đã được áp dụng cho ACTs. Tuy nhiên, báo cáo về ký sinh trùng ở Campuchia giảm nhạy cảm với ART trong in vivo đã xác nhận sự xuất hiện kháng thuốc mặc dù hiệu quả lâm sàng của ACTs không bị ảnh hưởng trong giai đoạn này. Điều chưa chắc chắn là có bao nhiêu người sử dụng trái phép ART đơn trị liệu dưới mức tối ưu và có thể đã góp phần vào tình trạng kháng này.

1. Quan sát thực địa

ART đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị ở Trung Quốc trong hơn 20 năm qua và cho đến nay vẫn chưa có tài liệu nào hướng dẫn về kháng ART tại quốc gia này. Năm 2003 Yang và cộng sự báo cáo tính nhạy cảm in vitro của P.falciparum với AS (Artesunate) giảm ba lần so với giữa năm 1988 và 1999 tại tỉnh Vân Nam, phía Tây nam Trung Quốc.

Bằng chứng được ghi nhận rõ ràng đầu tiên về kháng ART được cung cấp từ các kết quả của hai thử nghiệm riêng biệt về hiệu lực được tiến hành tại phía tây Campuchia, những thử nghiệm đầu tiên được tiến hành tại tỉnh Battambang sử dụng AS đơn trị liệu; 4 trong số 60 bệnh nhân tái phát và 2 bệnh nhân có thời gian làm sạch ký sinh trùng kéo dài. Ký sinh trùng phân lập từ hai bệnh nhân này có một sự gia tăng giá trị IC50 gấp bốn lần trong ex vivo so với những bệnh nhân được chữa khỏi, và tăng gấp 10 lần so với thể vô tính tham chiếu. Thử nghiệm thứ hai được tiến hành tại Campuchia và Thái Lan sử dụng AS đơn trị liệu và AS kết hợp với mefloquine. Kết quả là thời gian làm sạch ký sinh trùng ở bệnh nhân Campuchia có sự trì hoãn đáng kể, cho thấy chủng P.falciparum ở Campuchia đã giảm nhạy cảm với AS. Tuy nhiên, một vài kiểu hình thay đổi khác đã được xác định. Không giống như thử nghiệm đầu tiên ở Thái Lan và Campuchia, các chủng phân lập được trong thử nghiệm này cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong tính nhạy cảm của chúng (các giá trị IC50) đối với DHA (Dihydroartemisinine) hoặc AS khi đo lường bằng cách sử dụng các xét nghiệm thử nhạy cảm thuốc in vitro thông thường. Không có tương quan giữa sự trì hoãn làm sạch ký sinh trùng và các thử nghiệm marker phân tử giả định như pfmdr1, pfATPase6, pfcrt, bộ gen 6 kb của ty thể và pfubp-1 được tìm thấy. Mặc dù kháng thuốc được xác định là do di truyền, các cơ chế phân tử về kháng hiện vẫn chưa biết rõ. Các kết quả nghiên cứu rộng hơn về bộ gen từ các mẫu phân lập đang bắt đầu được công bố, và có thể giúp xác định những thay đổi liên quan đến kiểu hình trì hoãn sự làm sạch.

Giảm tính nhạy cảm của ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng đối với ART được đưa ra như một lời giải thích cho thời gian làm sạch kéo dài ghi nhận tại Campuchia. Mô hình toán học của giả thuyết này được dùng để đánh giá thời gian làm sạch ký sinh trùng cho mỗi bệnh nhân tham gia thử nghiệm. Giả thuyết này cũng giải thích lý do tại sao trong thử nghiệm nhạy cảm in vitro thông thường để đánh giá hiệu lực của thuốc đến quá trình trưởng thành của ký sinh trùng từ thể tư dưỡng đến thể phân liệt đã không phát hiện bất kỳ sự khác biệt nào về giá trị IC50 giữa thời gian làm sạch bình thường và kéo dài của ký sinh trùng, sự thay đổi tính nhạy cảm gây ra bởi kháng thuốc ở giai đoạn tư dưỡng dự đoán sẽ nhỏ hơn sức đề kháng của tất cả các giai đoạn, và thử nghiệm tính nhạy cảm in vitro thông thường không đủ để đo lường sự khác biệt nhỏ.

ART gây ra trạng thái ngủ được đề xuất như là lý do về thử nghiệm hiệu lực thuốc in vitro thông thường không phát hiện kháng ART. Trong các thử nghiệm thông thường, ký sinh trùng tiếp xúc với thuốc trong 24-48 giờ trước khi bổ sung chất chỉ thị tăng trưởng (ví dụ, 3H-hypoxanthine), thời gian này thích hợp hơn để ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng đi vào trạng thái ngủ. Vì vậy Tucker và cộng sự đưa ra giả thuyết bằng cách thêm 3H-hypoxanthine tại thời điểm không (tức là, cùng một lúc với thuốc) bất kỳ sự khác biệt nào trong tăng trưởng của thể tư dưỡng kháng thuốc sẽ được quan sát thấy. Dữ liệu trong các thử nghiệm dòng có nguồn gốc từ kháng ART in vitro của P.falciparum biến đổi khẳng định giảm nhạy cảm của các dòng W2 và D6 kháng ART với acid artelinic (AL), ART, và DHA. 

Hai nhiệm vụ cấp bách đối với chương trình phòng chống sốt rét:

(1) Có các ổ chứa ký sinh trùng kháng ART và lây lan của nó có thể dẫn đến mất hiệu lực của ACT trên diện rộng và làm tăng tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh sốt rét; 

(2) Kiểm soát sự xuất hiện của kháng ART ở các khu vực khác nhau. Để đạt được các mục tiêu quan trọng của y tế dự phòng, cần phải xác định sự thay đổi của kiểu hình và kiểu gen liên quan tới ký sinh trùng kháng thuốc và hiểu sâu hơn về sinh học và các cơ chế phân tử của kháng thuốc.

2. Kháng ART trong phòng thí nghiệm

Sử dụng ký sinh trùng kháng thuốc phòng thí nghiệm có thể cung cấp thông tin quan trọng về thay đổi kiểu hình và kiểu gen liên quan tới kháng thuốc. Với mục đích này, nhiều phòng thí nghiệm đã phát triển nuôi cấy các dòng ký sinh trùng dung nạp/kháng ART phù hợp. Những dòng này đã được sử dụng để nghiên cứu về sinh học và cơ chế kháng, tuy nhiên rất nhiều dòng kháng trước đó đã được chứng minh là không ổn định hoặc khi đo bằng thử nghiệm sự nhạy cảm in vitro chỉ đạt được mức kháng thuốc tương đối thấp, trong khi các dòng khác không có sẵn để nghiên cứu. Một nghiên cứu gần đây cho thấy việc lựa chọn một dòng P.Falciparum dung nạp với ART có thể chịu được nồng độ cao hơn 7000 lần IC50 ban đầu trong vòng 48-96 giờ và phục hồi sau khi tác dụng của thuốc đã hết. Điều thú vị là chỉ có ký sinh trùng được nuôi cấy ở giai đoạn tư dưỡng dưới áp lực của thuốc được quan sát thấy, và không có dấu hiệu cho thấy ký sinh trùng có thể phát triển liên tục dưới áp lực của thuốc. Sự thay đổi về kiểu hình trong dòng thích nghi được phục hồi từ thể ngủ sớm hơn so với dòng cha mẹ của chúng. Không phát hiện có sự thay đổi trong giá trị IC50 in vitro của dòng này và xác định không có sự liên quan đến marker kháng thuốc. Phân tích bản sao chỉ phát hiện những thay đổi đáng kể trong sự biểu hiện của 6 gene xuất xứ từ một nhóm mã hóa protein mà phần lớn liên quan đến sự biến đổi kháng nguyên. Dòng thích nghi có thể chịu được nồng độ thuốc cao trong một thời gian ngắn và phục hồi nhanh chóng, cho thấy dòng này chỉ thay đổi về trạng thái ngủ, hơn là phát triển đầy đủ khả năng đề kháng để từ đó ký sinh trùng có thể trưởng thành và nhân lên dưới áp lực của thuốc.

Chavchich và cộng sự cũng lựa chọn dòng ký sinh trùng in vitro có khả năng kháng AL, một dẫn xuất của ART, từ ba dòng cha mẹ khác nhau. Các giá trị IC50 của những dòng này tăng nhẹ từ 2-5 lần ở lần đầu tiên và lên đến 12 lần sau khi đổi thuốc mới. Ngược lại, dòng dung nạp thuốc có thể phát triển liên tục trong ít nhất 20 ngày dưới áp lực thuốc AL ở những nồng độ mà chúng đã trở nên thích nghi, và gấp 17 lần so với giá trị IC50 của ký sinh trùng dòng cha mẹ. Những thay đổi quan sát thấy trong các giá trị IC50 kèm với sự gia tăng số lượng bản sao, biểu hiện mRNA, và biểu hiện protein của gen pfmdr1, 2 trong 3 dòng kháng. Các giá trị IC50 đã đảo ngược một phần khi khử khuyếch đại của pfmdr1, xảy ra sau khi nuôi cấy 3 tháng không có áp lực của thuốc.

Một nghiên cứu gần đây cho thấy không có sự đồng nhất giữa thế hệ bố mẹ và con cháu HB3 x Dd2 nhạy cảm chéo in vitro với ART. Các đa hình của gen pfmdr1, cộng thêm với locus trên nhiễm sắc thể 12 và 13 đã được xác định là góp phần vào sự nhạy cảm với ART. Tiếp theo sự ổn định của P.falciparum kháng ART từ một thế hệ con cháu F1 của một di truyền chéo dẫn đến tăng trung bình 2 đến 4 lần nồng độ IC50. Tuy nhiên không xác định được thêm những thay đổi về di truyền.

3. Kiểu hình của dòng kháng ART phòng thí nghiệm

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm gần đây cho thấy kiểu hình của các dòng kháng AL trước đó. Tương tự như những dòng này, khi được tiếp xúc với AL cũng như ART và DHA với mức độ cao hơn đã gây kháng chéo với các dẫn xuất ART. Qua khảo sát chi tiết trạng thái ngủ và các đặc điểm sinh trưởng của các dòng kháng, các nghiên cứu này đã xác định được ba thay đổi trong ký sinh trùng:

1) Giảm độ nhạy cảm trong giai đoạn tư dưỡng để khởi phát chuyển sang trạng thái ngủ. So với các dòng cha mẹ, một tỷ lệ ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng giảm đáng kể để trở thành thể ngủ sau một lần tiếp xúc duy nhất với AL. Ví dụ, dòng cha mẹ chỉ cần đến 20 ng/mL AL trong 6 giờ, đủ để gây ra sự “bùng nổ” trên 90% thể tư dưỡng chuyển sang trạng thái ngủ, trong khi đối với dòng ký sinh trùng kháng thuốc, với nồng độ 640 ng/mL AL, cao hơn ít nhất 8 lần nồng độ mà nó đã đáp ứng, dẫn đến ~80% thể tư dưỡng chuyển sang trạng thái ngủ, kiểu hình này hỗ trợ giả thuyết cho rằng trạng thái ngủ là một phản ứng với stress được kích hoạt khi ký sinh trùng không thể chịu được áp lực thuốc. Nó là phản xạ của ký sinh trùng kháng lại AL.

2) Giảm sự nhạy cảm trong giai đoạn trưởng thành của ký sinh trùng. Ký sinh trùng giai đoạn trưởng thành trong nuôi cấy được ghi nhận sau 24 giờ dưới áp lực của thuốc, đã phát triển bình thường, gợi ý rằng một số ký sinh trùng có thể phát triển và nhân lên dưới nồng độ thuốc mà với nồng độ thuốc này có thể giết chết thế hệ cha mẹ của chúng.

3) Khi gây ra thể ngủ (sử dụng một nồng độ thuốc cao hơn) các ký sinh trùng kháng thuốc phục hồi nhanh chóng và gây ra tái phát sớm.

Đây là 3 kiểu hình thay đổi cung cấp các bằng chứng về kháng ART mà trước đó trong các phòng thí nghiệm hoặc trong lĩnh vực này đã không được báo cáo.

4. Giả thuyết cho sự phát triển của kháng ART

Kết hợp quan sát lâm sàng, in vitro, động vật và nghiên cứu lý thuyết, một giả thuyết đưa ra là kháng ART phát triển như là một quá trình hai bước liên quan đến trạng thái ngủ. Trong trường hợp không có đề kháng, ký sinh trùng hoang dại dễ bị ảnh hưởng bởi các dẫn xuất ART. Khi tiếp xúc với ART, ký sinh trùng nhạy cảm kích hoạt một phản ứng stress, kết quả là gần 100% ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng trở nên không hoạt động (thể ngủ). Ngược lại, ký sinh trùng giai đoạn trưởng thành bị chết bởi thuốc. Một tỷ lệ rất nhỏ ký sinh trùng thể ngủ phục hồi với một tỷ lệ quyết định bởi mức độ stress, đó là nồng độ của thuốc. Trong trường hợp ART đơn trị liệu, ký sinh trùng thể ngủ phục hồi gây ra thất bại điều trị ở một số bệnh nhân, phụ thuộc vào đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Khi ART được sử dụng là một phần của ACT, các thuốc đồng tác dụng có thể có một tác dụng trực tiếp bằng cách làm giảm số lượng ký sinh trùng thể ngủ phục hồi trở lại, cũng như giết chết ký sinh trùng sau khi phục hồi. Đây là thuốc áp dụng cho đa số các vùng sốt rét lưu hành.

Bước đầu tiên hướng tới sự phát triển của kháng ART liên quan đến những thay đổi trong trạng thái ngủ. Sau khi tiếp xúc lặp đi lặp lại với ART một số ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng non thích nghi và sự tiếp xúc với ART gây ra một mức độ thấp hơn stress, khiến một tỷ lệ nhỏ hơn đáng kể ký sinh trùng thể tư dưỡng trở thành thể ngủ. Đây là những thể tư dưỡng non có thể phát triển thành thể tư dưỡng trưởng thành dưới áp lực thuốc, nhưng có lẽ ở một tốc độ giảm. Kết quả là ký sinh trùng trưởng thành chậm hơn gây ra ký sinh trùng còn lại trong vòng 48-72 giờ và gây kéo dài thời gian làm sạch ký sinh trùng và thay đổi đường cong của sự làm sạch. Khi ký sinh trùng đạt tới giai đoạn trưởng thành chúng bị giết bởi thuốc vì các giai đoạn này vẫn còn nhạy cảm với ART. Thông thường trong thử nghiệm tính nhạy cảm in vitro sẽ không phát hiện ký sinh trùng có những thay đổi đáng kể trong giá trị IC50 ở giai đoạn này vì ở giai đoạn trưởng thành sự nhạy cảm với ART của ký sinh trùng là bằng nhau. Các dòng được phân lập ở Campuchia và các dòng kháng thuốc và nhạy cảm phù hợp với giai đoạn này của phát triển kháng thuốc. 

Nếu kháng thuốc tiếp tục phát triển đến giai đoạn thứ hai, không chỉ ở giai đoạn tư dưỡng mà còn ở giai đoạn trưởng thành, ký sinh trùng trở nên ít nhạy cảm với ART. Ở giai đoạn này, dưới áp lực thuốc ở nồng độ điều trị không còn đủ để kích hoạt các phản ứng stress của trạng thái ngủ trong phần lớn thể tư dưỡng và ký sinh trùng giai đoạn trưởng thành có thể phát triển và nhân lên dưới áp lực thuốc. Những ký sinh trùng này sẽ gây ra thất bại điều trị sau khi dùng ART đơn trị liệu và ACT tùy thuộc vào hiệu quả của các thuốc đồng tác dụng. Những ký sinh trùng này sẽ biểu hiện một giá trị IC50 tăng khi thử nghiệm tính nhạy cảm in vitro theo qui ước. Khi liều thuốc cao hơn được sử dụng, các đáp ứng với stress một lần nữa có thể được kích hoạt và ký sinh trùng sẽ sử dụng cơ chế ngủ để tồn tại dưới áp lực cao của thuốc. Rất may trường hợp này đã không được tìm thấy trong thử nghiệm thực địa nhưng ký sinh trùng kháng AL phát triển in vitro phù hợp với giai đoạn này của kháng thuốc.

Những thay đổi phân tử gây ra kháng thuốc giai đoạn 1 và 2 chưa được biết đến. Các yếu tố liên quan tới trạng thái ngủ chính nó cần phải được làm sáng tỏ. Có thể là các thay đổi phân tử cùng gây ra cho cả hai giai đoạn kháng thuốc, mặc dù nhiều khả năng có một cơ chế khác tồn tại cho sự dung nạp ART trong giai đoạn tư dưỡng và sự sống sót của ký sinh trùng giai đoạn trưởng thành. Một giả thuyết đưa ra là ở giai đoạn 1, giai đoạn tư dưỡng của ký sinh trùng có thể phát triển một mức độ dung nạp với ART bằng cách thay đổi các mục tiêu tác dụng của thuốc hoặc chất vận chuyển. Dung nạp này làm giảm mức độ stress mà ký sinh trùng đã trải qua trong thời gian tiếp xúc với ART, được phản ánh bởi những thay đổi trong trạng thái ngủ, cụ thể là ký sinh trùng ít chuyển sang trạng thái ngủ. Một cơ chế để đạt được điều này có thể thông qua điều chỉnh cơ chế của chu kỳ tế bào. Sự đề kháng của ký sinh trùng trưởng thành, thể hiện trong giai đoạn 2, có thể liên quan đến sự thay đổi đáng kể hoặc nhiều hơn (sự đột biến) mục tiêu tác dụng của thuốc hoặc thay đổi chất vận chuyển. Bằng chứng phòng thí nghiệm cho thấy có sự khuếch đại của pfmdr1 có thể có liên quan đến sự tồn tại của ký sinh trùng giai đoạn trưởng thành, mặc dù nó có vẻ như không phải hoàn toàn do mình nó gây ra. Các gen khác như pfATPase 6, pftctppfubp-1 cũng có thể tham gia vào quá trình này mặc dù chúng không liên quan đến giai đoạn đầu của sự phát triển kháng thuốc.

Hiện nay, xác định marker đề kháng ART là cách đánh giá tốt nhất về ký sinh trùng giảm tỷ lệ làm sạch như là một phần của thử nghiệm hiệu quả điều trị. Những thử nghiệm này rất đắt tiền và tốn thời gian, một thử nghiệm in vitro sẽ cải thiện rất nhiều trong giám sát kháng thuốc. Khả năng dung nạp ART của ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng non có thể được sử dụng như là một marker cho một trong các thử nghiệm tính nhạy cảm in vitro mới mà đầu ra không phải là tỷ lệ phần trăm ký sinh trùng có thể phát triển thành thể phân liệt, thay cho tỷ lệ thể tư dưỡng còn tồn tại, hoặc tỷ lệ phần trăm của các thể tư dưỡng non trở thành thể ngủ sau khi tiếp xúc với thuốc. Nếu kháng ART dừng lại ở giai đoạn 1, có thể không phát hiện được sự thay đổi đáng kể IC50 trong ký sinh trùng được phân lập. Một hiểu biết sâu hơn về các quá trình cơ bản của sự phát triển kháng thuốc, và cơ chế kháng, sẽ hỗ trợ rất nhiều cho các nỗ lực về giám sát, ngăn chặn và loại trừ ký sinh trùng kháng ART, và quan trọng nhất là để phòng ngừa các hậu quả bất lợi có thể gây ra cho sức khỏe cộng đồng bởi sự lây lan của đề kháng ART.

TS. Phùng Đức Truyền
(Lược dịch từ International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance 2 pp.252-255, Published by Elsevier)

(Cập nhật: 13:24 PM - 25/09/2015)




Các bản tin khác:

  Cuộc tìm kiếm vắc xin sốt rét đem lại hy vọng cho chữa trị ung thư (30/10/2015)
  Điều tra cắt ngang các marker phân tử K13: sự lan rộng của Plasmodium falciparum kháng artemisinin ở Myanmar và khu vực Đông Nam Á (25/09/2015)
  Công văn về việc loại trừ sốt rét ở địa phương đến năm 2020 (21/09/2015)
  Công văn về việc loại trừ sốt rét ở địa phương đến năm 2016 (21/09/2015)
  Hiểu biết về ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc: nền tảng khoa học của Y tế dự phòng (17/09/2015)
  Hứa hẹn của phương pháp điều trị với thuốc Artemisinin phối hợp (17/09/2015)
  Artemisinin gây ra trạng thái ngủ ở Plasmodium falciparum và tái phát sốt rét (17/09/2015)
  Những thách thức về phòng chống bệnh sốt rét, sốt xuất huyết (03/09/2015)
  Di cư, di biến động và sốt rét ở Campuchia (một nghiên cứu về hoạt động của người dân liên quan đến chiến lược phòng chống và loại trừ sốt rét) (26/08/2015)
  Triển vọng về điều trị mới ngăn chặn ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc từ các hợp chất (24/08/2015)
  Những thách thức trong kiểm soát bệnh sốt rét ở phụ nữ mang thai (12/08/2015)
  Đột biến gene mới báo hiệu kháng thuốc sốt rét ở Châu Phi (22/05/2015)
  Chỉ đạo giải quyết sốt rét gia tăng ở Bình Phước (21/05/2015)
  Báo cáo, điều tra và xử lý ca bệnh trong loại trừ sốt rét: mô hình “1 - 3 - 7” của Trung Quốc (20/04/2015)
  Sốt rét kháng thuốc có nguy cơ lây lan sang Ấn Độ tạo nên cuộc khủng hoảng y tế toàn cầu (12/03/2015)
Tiêu điểm
Trung tâm TT Dịch vụ khoa học kỹ thuật
Cổng thông tin điện tử Phòng chống giun sán
Kham chua benh- Dich vu KHKT