Hiểu biết về ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc: nền tảng khoa học của Y tế dự phòng

1. Plasmodium falciparum và vấn đề kháng thuốc


Kháng thuốc là vấn đề cơ bản của di truyền, xảy ra trong hầu hết các trường hợp điều trị ký sinh trùng và phụ thuộc rất nhiều vào hiệu lực của thuốc, vì vậy sự phát triển và lây lan của sự đề kháng với những loại thuốc này là không thể tránh khỏi. Vai trò của di truyền học là để hiểu được cuộc chạy đua giữa ký sinh trùng kháng thuốc và chiến lược phát triển các loại thuốc mới để khống chế sự kháng thuốc. Sử dụng thuốc hợp lý có thể kéo dài thời gian có hiệu lực của mỗi loại thuốc trước khi các loại thuốc “cũ” được loại bỏ và các loại thuốc mới có hiệu quả hơn được thay thế. Trong trường hợp này, các nghiên cứu khoa học cơ bản về ký sinh trùng có tác động lớn đến quyết định sức khỏe cộng đồng về điều trị bệnh nhân, phát triển các loại thuốc mới và về việc áp dụng các phương pháp hiện đại để hiểu làm thế nào và tại sao ký sinh trùng phát triển kháng thuốc. Nghiên cứu này sử dụng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum để tìm hiểu quá trình của sự kháng thuốc. Sử dụng P.falciparum làm mẫu thử nghiệm vì nó là một tác nhân lây nhiễm lan rộng và có khả năng gây tử vong cho con người đã được nghiên cứu sâu hơn 100 năm qua. Việc áp dụng các phương pháp phân tử để nghiên cứu P.falciparum song song với việc phát triển các kỹ thuật này trong những năm 1990, và xu hướng này đã phát triển mạnh cùng các phương pháp nghiên cứu về gen. Dùng phương pháp phân tử để phân tích P.falciparum được hỗ trợ bởi ba yếu tố:

­ - Bệnh sốt rét thường được chẩn đoán bằng cách chích máu đầu ngón tay và soi trên kính hiển vi để xác định số lượng ký sinh trùng trong máu của bệnh nhân. Bước tiếp theo, một lượng nhỏ máu bị nhiễm được thấm vào một dải giấy lọc cung cấp lượng lớn DNA của ký sinh trùng, và đảm bảo một nguồn ổn định dài hạn của ký sinh trùng được phân lập để phân tích.

­ - Sự phát triển của các phương pháp để tinh sạch DNA và khuếch đại PCR từ các mẫu này cho phép xác định nhanh những thay đổi về di truyền và kỹ thuật này đã trở thành thường qui trong nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.

­- Rất nhiều các gen lõi mã hóa và các chức năng cơ bản của tế bào trong P.falciparum được bảo toàn đáng kể, đa hình nucleotide sợi đơn (SNPs) trong các gen liên quan đến kháng thuốc hầu như luôn luôn có liên quan đến kiểu hình được quan sát thấy, và không bị che lấp bởi đa hình trong codon, loại không góp phần vào đề kháng thuốc.

Bệnh sốt rét đã được điều trị từ hàng trăm và có thể hàng ngàn năm, bắt đầu với thuốc cổ truyền qinghaosu của Trung Quốc và quinine trong thế kỷ 17, nhưng thuốc chống sốt rét được sản xuất và sử dụng rộng rãi đầu tiên là chloroquine. Nó được lưu hành rộng rãi sau chiến tranh thế giới thứ hai và được sử dụng để điều trị hàng trăm triệu bệnh nhân sốt rét. Trong giai đoạn đầu, thước đo hiệu quả duy nhất của thuốc là đánh giá các triệu chứng của bệnh nhân sau khi điều trị. Đến năm 1957, đã ghi nhận thất bại trong điều trị với phác đồ điều trị chuẩn trên một số bệnh nhân, đầu tiên ở Đông Nam Á và châu Mỹ Latin, vào cuối năm 1980 đáp ứng kém đã lan khắp châu Phi. Trong lĩnh vực sức khỏe cộng đồng, hiệu quả điều trị sốt rét được đánh giá theo hướng dẫn được cập nhật thường xuyên bởi WHO. Việc đánh giá tốn nhiều thời gian và tiền bạc: điều trị bệnh nhân tốn ít nhất 28 ngày để đảm bảo tất cả các triệu chứng đã được giải quyết và đã sạch ký sinh trùng trong máu bệnh nhân. Dựa vào khuyến cáo của WHO, cơ quan y tế tại mỗi quốc gia đánh giá sự thành công trong điều trị sốt rét dựa trên tỷ lệ bệnh nhân được điều trị khỏi với loại thuốc đó. 

Từ các quan điểm trên về sức khỏe cộng đồng, xu hướng giảm thành công trong điều trị là những yếu tố quan trọng trong đó đề kháng với một loại thuốc là một vấn đề ngày càng được quan tâm. WHO hướng dẫn thiết lập một hiệu quả điều trị 90% mà một loại thuốc thay thế nên được khuyến khích. Thử nghiệm trên người luôn là vấn đề khó khăn, do đó các phương pháp thử nghiệm bổ sung làm tăng thêm các thông tin thu được từ thử nghiệm trên người luôn được quan tâm phát triển. 

2. Xác định các marker phân tử kháng thuốc chống sốt rét

2.1. Vấn đề khó khăn với một marker phân tử: chloroquin

Xác định sự thay đổi phân tử trong ký sinh trùng có liên quan tới điều trị thất bại bằng chloroquine chỉ có thể được thực hiện sau khi xây dựng các phương pháp thích hợp để nuôi chủng P.falciparum trong phòng thí nghiệm, và phát triển các phương pháp để đánh giá dược lực của thuốc trong in vitro. Đây là một tiến bộ quan trọng, và P.falciparum là một ký sinh trùng có thể được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.

Xác định sự thay đổi di truyền có tính kháng với chloroquine, hiệu quả và phân tích chi tiết về di truyền giữa ký sinh trùng đáp ứng và kháng với chloroquine cần một bước đột phá. Phân tích phân tử cho phép xác định chi tiết về đa hình nucleotide sợi đơn SNPs, làm thay đổi các mã khóa acid amin vận chuyển kháng chloroquine được mã hóa bởi các gen pfcrt (PF3D7_0709000) trong P.falciparum. Sự liên kết này được hỗ trợ mạnh mẽ bởi sự tương quan giữa các marker ứng với pfcrt của ký sinh trùng nhạy cảm với chloroquine trong các nghiên cứu phòng thí nghiệm.

Giá trị thực tiễn của nghiên cứu phòng thí nghiệm dựa trên thông tin đã được xác nhận khi các nhóm làm việc trong lĩnh vực phát triển phương pháp cơ bản RFLP dựa trên sợi đơn phân tử chứng minh bệnh nhân bị nhiễm ký sinh trùng sốt rét mang alen pfcrt 76T “kháng thuốc” có khả năng thất bại trong điều trị bằng chloroquine nhiều hơn những người mang ký sinh trùng có một alen K76 “nhạy cảm”, Nhiều nhóm nghiên cứu phân lập SNPs từ các vùng khác nhau đã quan sát thấy ở những gen pfcrt, có hơn một alen kháng thuốc được xác định. Các alen kháng thuốc phổ biến nhất mang một kiểu sợi đơn với thay thế giữa codon 72 và 76, thường được mã hóa các acid amin CVIET hoặc SVMNT. Nhưng quan trọng nhất, các đột biến K76T trong pfcrt được quan sát thấy trong tất cả các chủng kháng chloroquine từ một loạt các địa điểm trên toàn thế giới.

Tiếp tục phân tích phân tử chứng minh một gen thứ hai đã được biết đến của P.falciparum gắn liền với đáp ứng chloroquine, gen đa kháng thuốc 1 (PF3D7_0523000), pfmdr1. Một lần nữa, in vitro và các mối tương quan phân tử liên kết đa hình trong pfmdr1 cũng như các kiểu sợi đơn pfcrt 72-76 đến việc kháng amodiaquine, thuốc chống sốt rét tương tự chloroquine và tăng số lượng bản sao của gen kháng với mefloquine và lumefantrine, hai thuốc chống sốt rét khác.

2.2. Marker đề kháng với các antifolat

Pyrimethamine được sản xuất dưới tên Daraprim, nghiên cứu này được công ty Burroughs Wellcome tiến hành vào năm 1950. Trong cùng thời gian, Gertrude Elion và George Hitchings chứng minh tác động của nhóm thuốc này là chất ức chế cạnh tranh với một enzyme quan trọng trong tổng hợp acid nucleic, khử dihydrofolate reductase và pyrimethamine ức chế chủ động một số loài ký sinh trùng sốt rét. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu đầu tiên ở Đông Phi của David Clyde cho thấy hiệu quả của pyrimethamine giảm nhanh chóng chỉ trong vòng 6 tháng khi sử dụng một mình pyrimethamine để dự phòng. Greenberg và Richeson đã phát hiện sulfadoxine có tác dụng hiệp đồng làm tăng tác dụng chống ký sinh trùng của pyrimethamine và sau đó, Brown chứng minh sulfadoxine ức chế một enzym khác trong sinh tổng hợp folate, dihydropteroate synthase. Cuối cùng, ứng dụng tác dụng hiệp đồng giữa hai hoạt chất vào mục đích làm chậm lại sự đề kháng thuốc của ký sinh trùng, pyrimethamine kết hợp với sulfadoxine với tên Fansidar được sản xuất và đưa vào điều trị.

Những nghiên cứu sinh hóa cơ bản cung cấp thông tin cho các mục tiêu điều trị của mỗi loại thuốc, và cho phép xác định các đột biến đặc biệt trong P.falciparum ở vùng dihydrofolate reductase của gen dihydrofolate reductase-thymidylate synthase, pfdhfr (PF3D7_0417200) và gen dihydropteroate synthase, pfdhps (PF3D7_0810800) làm giảm tính nhạy cảm của P.falciparum đối với pyrimethamine và sulfamid tương ứng. Trong cùng thời gian, phương pháp phân tử đơn giản cũng được thiết lập cho phép đánh giá SNPs có liên quan đến pfdhfr và gen pfdhps bằng cách sử dụng những mẫu máu thu thập được từ thực địa. Những phương pháp này được áp dụng một cách nhanh chóng để đánh giá mức phổ biến của alen gắn liền với kháng thuốc SP. Cũng như chloroquine, mối quan hệ đến các phân tử làm thay đổi hiệu lực của thuốc, đã được xác nhận qua phân tích ký sinh trùng đáp ứng với mỗi loại thuốc trong phòng thí nghiệm, và tương quan với hiệu quả điều trị ở những bệnh nhân được điều trị bằng SP. Cuối cùng là, ký sinh trùng có mang một sự kết hợp đặc trưng của một alen pfdhfr với 3 đột biến (trong codon N51I/C59R/S108N) và một alen pfdhps với 2 đột biến (A437G/K540E), biệt danh là kiểu gen đột biến gấp 5 lần hoàn thành một chu kỳ, có liên quan mạnh tới thất bại điều trị. Bảng 1 tóm tắt các SNPs phổ biến nhất được xác định là marker phân tử kháng chloroquine và SP, cũng như amodiaquine, lumefantrine và mefloquine, và tất cả các loại hoạt chất hiệp đồng tác dụng hiện đang sử dụng trong phương pháp điều trị kết hợp artemisinin (ACTs).

Bảng 1. Alen liên quan tới hiệu quả điều trị của thuốc chống sốt rét đã dùng (trong tất cả các trường hợp, các acid amin được mã hóa bởi các alen được liệt kê. Trong alen ở các loại codon hoang dại giả thiết được mã hoá ở vị trí đó, các acid amin được liệt kê trước số codon; nếu nó là một alen có nguồn gốc, các acid amin sau codon được nhấn mạnh và ký hiệu được bo đậm và gạch chân. “Shorthand”: marker thường được đánh giá và đại diện cho các kiểu đơn hoàn chỉnh).



3. Chuyển marker phân tử vào các công cụ hữu ích


3.1. Công cụ cho sức khỏe cộng đồng

 Phương pháp này đã được áp dụng cho các bệnh nhân bị nhiễm ký sinh trùng mang alen “kháng thuốc” pfcrt 76T có nhiều khả năng thất bại trong điều trị bằng chloroquine hơn những người có ký sinh trùng mang một alen K76 “nhạy cảm”. Một vấn đề quan trọng đặt ra là có sự hiện diện của ký sinh trùng kháng thuốc trong lần lây nhiễm ban đầu được sử dụng để dự đoán xem bệnh nhân đó chắc chắn sẽ thất bại trong điều trị? Câu trả lời là không có, nhiều bệnh nhân có ký sinh trùng “kháng thuốc” được điều trị khỏi hoàn toàn, bởi vì họ đã phát triển khả năng miễn dịch một phần từ lần lây nhiễm trước đó, do đó hệ thống miễn dịch của họ thường làm sạch ký sinh trùng, bao gồm cả những trường hợp đã kháng với chloroquine. Kết quả là, ngay cả khi một ký sinh trùng gây bệnh đã kháng với thuốc, một số bệnh nhân, đặc biệt là người lớn trong khu vực có sự lây truyền mạnh, khi bị nhiễm đã được chữa khỏi. Những nghiên cứu được thực hiện ở các địa điểm khác nhau, cho thấy rõ ràng rằng sự lan truyền của một kiểu gen “đề kháng thuốc” trong quần thể ký sinh trùng có thể dự đoán khả năng chung mà bệnh nhân từ các khu vực đó sẽ được chữa khỏi. Tuy nhiên, vì mối quan hệ giữa các marker phân tử và kết quả điều trị là gián tiếp, tiềm năng của phương pháp này áp dụng trong lĩnh vực sức khoẻ cộng đồng là rất khó khăn.

Những công cụ này còn thúc đẩy phân tích hồi cứu ở những địa điểm nghiên cứu dài hạn nơi mà tỷ lệ marker có mối tương quan với kết quả điều trị lâm sàng và những xu hướng đáp ứng in vitro của ký sinh trùng. Tổng hợp những đánh giá xác nhận việc sử dụng sinh học phân tử trong phòng thí nghiệm dựa vào ký sinh trùng để cung cấp các bằng chứng có giá trị để hỗ trợ thiết thực và khuyến nghị về việc sử dụng thuốc chống sốt rét.

3.2. Tỷ lệ và phân bố các marker phân tử

Khả năng nhận dạng ký sinh trùng mang marker phân tử được xác định đã mở ra một hướng mới để áp dụng các phân tích phân tử để đo lường sự phân bố của mỗi marker, trong các mẫu thử lấy từ bệnh nhân hoặc trong điều tra cộng đồng. Hàng trăm tài liệu về mức độ nhiễm trên toàn thế giới của các alen có liên quan tới khả năng kháng chloroquine, SP, amodiaquine và mefloquine trong bốn locus được xác định (pfdhfr, pfdhps, pfcrtpfmdr1) đã được mô tả từ năm 2000. Các tài liệu này được xem xét và cập nhật thường xuyên bởi WHO và cung cấp các thông tin được sử dụng để đưa ra các quyết định cho sức khoẻ cộng đồng

4. Tác động đến sức khỏe cộng đồng

Cả chloroquine và SP đã loại bỏ khỏi danh mục thuốc ở khu vực Đông Nam Á trong những năm 1970 và 1980, và ở nhiều nơi đã được thay thế bằng mefloquin, nhưng chloroquine vẫn là thuốc sốt rét chính ở châu Phi vào đầu những năm 2000. Cuối những năm 1990, hai nghiên cứu đã chứng minh tỷ lệ tử vong do sốt rét ở trẻ em người Senegal tăng từ 2 đến 5,5 lần, cũng trong khoảng thời gian này khi nghiên cứu về phân tử trong phòng thí nghiệm cho thấy ký sinh trùng kháng chloroquine ngày càng phổ biến. Tổng số người chết do sốt rét ít bị ảnh hưởng, vì nhiều người lớn bị nhiễm không biểu hiện các triệu chứng của bệnh hoặc họ ít có nhu cầu điều trị bằng thuốc. Mặc dù có những cảnh báo, nhiều nước vẫn tiếp tục sử dụng chloroquine trong một thời gian dài sau khi hiệu quả của nó đã giảm thấp, đặc biệt là ở trẻ nhỏ, nhóm có nguy cơ cao bởi bệnh sốt rét. Trong những năm đầu của thập niên 2000 một sự thay thế SP được thực hiện ở một số nước, nhưng hiệu quả của nó đã nhanh chóng bị giảm thấp do sức đề kháng thuốc, đặc biệt là ở Đông và Nam châu Phi.

5. Marker phân tử như các công cụ dịch tễ học

Để hiểu được sự đề kháng và tiến hóa của nó, điều quan trọng nhất là xác định được nguồn gốc của các alen kháng thuốc. Có phải chúng phát sinh lặp đi lặp lại ở nhiều nơi, hoặc chỉ trong một vài ổ và sau đó lan rộng? Câu hỏi này đã được trả lời cho chloroquine và SP trong một loạt các tài liệu nghiên cứu về tính đa hình cao của các vệ tinh nằm bên sườn các vùng mã hóa của các alen liên quan tới kháng thuốc ở Nam Mỹ, các vệ tinh cho thấy alen đặc trưng của cả pfcrtpfdhfr đã phát triển tại chỗ, và những alen này đã lan rộng trong châu lục bất cứ khi nào các thuốc lựa chọn được sử dụng mạnh mẽ, các tác giả cho rằng có thể có một nguồn gốc duy nhất của các alen kháng. Trong các chủng ở châu Phi, các alen kháng phổ biến nhất của pfcrt mã hóa các acid amin, CVIET trong codon 72-76, các alen kháng pyrimethamine cao “đột biến gấp ba” của pfdhfr, mã hóa các acid amin 51I, 59R, 108N (Bảng 1). Một trong các alen đã lan rộng ở châu Phi, và mỗi alen đó mang một mẫu vệ tinh hiển thị gần như bất biến và tiến hóa của kháng là một điều hiếm có. Bất ngờ lớn nhất không phải của các alen có nguồn gốc ở châu Phi. Thay vào đó, từng là một hậu duệ gần của một alen kháng chloroquine hoặc SP có nguồn gốc ở khu vực Đông Nam Á! Mỗi alen đã được đưa vào Đông Phi, có lẽ bởi du khách không có triệu chứng hoặc những người nhập cư từ một khu vực ở châu Á, nơi các alen kháng đã có mặt trong nhiều thập kỷ, sau đó lan truyền trong khoảng thời gian một thập kỷ bởi di chuyển của người bị nhiễm bệnh trên toàn châu Phi. Nghiên cứu hồi cứu các mẫu từ các khu vực mà các mẫu thuốc sử dụng đã được ghi nhận ở Senegal và ven biển Kenya cho thấy các alen pfdhfr nhập khẩu đã có mặt ở mức rất thấp, thậm chí trước khi SP được sử dụng trong các khu vực đó. Tuy nhiên, ngay sau khi tăng sử dụng thuốc, mức lan rộng của các alen kháng tăng cực kỳ nhanh chóng trong một vài năm, và cuối cùng được xác định lan rộng toàn châu lục. Với các mô hình tương đối đơn giản, một loạt các alen của pfdhpspfmdr1 được quan sát thấy trong các vùng ở châu Phi, và những alen này đã phát sinh và lây lan xa hơn tại địa phương.

Tóm lại, nghiên cứu này đã chứng minh rằng các marker phân tử có thể được sử dụng để xác định một cách nhanh chóng các vùng có ký sinh trùng kháng thuốc, phỏng đoán nguồn gốc của chúng và tìm theo những con đường về thời gian và không gian địa lý của chúng. Sự lây lan trên phạm vi rất rộng của ký sinh trùng kháng thuốc cũng nâng cao nhận thức rằng ký sinh trùng kháng thuốc có thể lây lan tại địa phương, nhưng cũng thể hiện một khả năng lan rộng khắp lục địa.

TS. Phùng Đức Truyền
(Lược dịch từ Molecular & Biochemical Parasitology 195, pp.107-110. Published by Elsevier B.V.)

(Cập nhật: 16:37 PM - 17/09/2015)




Các bản tin khác:

  Điểm tin y tế tuần 45 (16/11/2015)
  Bộ Y tế phê duyệt Đề án Vị trí việc làm của Viện Sốt rét – KST – CT TP. HCM (09/10/2015)
  Đoàn công tác của Bộ Y tế kiểm tra tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết tại tỉnh Đồng Nai (28/09/2015)
  Công văn v/v loại trừ sốt rét ở địa phương đến năm 2020 (21/09/2015)
  Công văn v/v loại trừ sốt rét ở địa phương đến năm 2016 (21/09/2015)
  Hứa hẹn của phương pháp điều trị với thuốc Artemisinin phối hợp (17/09/2015)
  Artemisinin gây ra trạng thái ngủ ở Plasmodium falciparum và tái phát sốt rét (17/09/2015)
  Những thách thức về phòng chống bệnh sốt rét, sốt xuất huyết (11/09/2015)
  Báo cáo tình hình sốt xuất huyết ở một số tỉnh trọng điểm từ đầu năm 2015 đến nay và kết quả hoạt động (09/09/2015)
  Di cư, di biến động và sốt rét ở Campuchia (một nghiên cứu về hoạt động của người dân liên quan đến chiến lược phòng chống và loại trừ sốt rét) (26/08/2015)
  Triển vọng về điều trị mới ngăn chặn ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc từ các hợp chất (24/08/2015)
  Chuyển đơn vị sự nghiệp công lập thành công ty cổ phần (24/08/2015)
  Bình luận về hoạt động phòng chống giun truyền qua đất trên thế giới từ khi bắt đầu tới nay (07/08/2015)
  Thuốc ức chế nhiễm trùng gây bệnh tiêu chảy (30/07/2015)
  Bệnh do sán máng (Schistosomiasis) xuất hiện châu Âu (01/07/2015)
Tiêu điểm
Trung tâm TT Dịch vụ khoa học kỹ thuật
Cổng thông tin điện tử Phòng chống giun sán
Kham chua benh- Dich vu KHKT